Daglige overførsler, arkivering af populationer og måling af kondition i det langsigtede evolutionseksperiment med Escherichia coli

I februar 1988 podede Richard Lenski tolv kolber indeholdende et defineret glukosebegrænset vækstmedium med klonale kulturer af Escherichia coli ved University of California, Irvine¹. Den følgende dag overførte han 1% af kulturen fra hver kolbe til et sæt nye kolber indeholdende frisk vækstmedium. Denne 1:100 fortynding gjorde det muligt for bakteriepopulationerne at udvide sig 100 gange, før de udtømte den tilgængelige glukose, svarende til ca. 62/3 generationer af celledelinger. Denne procedure blev gentaget den følgende dag og har været det hver dag siden med nogle få afbrydelser. Disse daglige overførsler er fortsat, selvom eksperimentet blev flyttet, først til Michigan State University i 1992 og derefter til University of Texas i Austin i 2022. Alt imens har nye mutationer løbende genereret genetisk variation i disse E. coli-populationer, og naturlig selektion har ført til, at udviklede celler udkonkurrerer deres forfædre.

Lenski designede dette eksperiment, nu kendt som Long-Term Evolution Experiment (LTEE), for at undersøge evolutionens dynamik og repeterbarhed. For at besvare disse spørgsmål inkluderede han flere vigtige funktioner i designet af den eksperimentelle opsætning og dens protokoller². Et af disse træk var det omhyggelige valg af en modelorganisme. De oprindelige tolv populationer blev alle startet fra enkelte kolonier, der delte en umiddelbar fælles forfader, Escherichia coli B stamme REL606. Denne stamme blev valgt, fordi den allerede var almindeligt anvendt i laboratorieindstillinger, reproduceret fuldstændigt aseksuelt, og indeholdt ingen plasmider eller intakte prophages ^3,4 - som alle gør det lettere at studere dens udvikling. Et andet valg, der forenklede eksperimentet, var at anvende en meget lav koncentration af glukose i vækstmediet for at begrænse tætheden af celler i hver kolbe efter vækst. Brug af en lav celletæthed var beregnet til at gøre det lettere at analysere ændringer i populationsegnethed ved at reducere potentialet for udvikling af økologiske interaktioner inden for populationer (f.eks. Ved krydsfodring)⁵.

REL606 er ikke i stand til at bruge ʟ-arabinose som kulstof- og energikilde (Ara−) på grund af en punktmutation i araA-genet. Før LTEE blev startet, blev en spontan mutant med en gendannet araA-sekvens, betegnet REL607, isoleret fra REL606⁶. REL607 er i stand til at vokse på ʟ-arabinose (Ara⁺). REL606 blev brugt til at starte seks af LTEE-populationerne, og REL607 blev brugt til at starte de andre seks. Arabinose er ikke til stede i vækstmediet, der anvendes under LTEE, så REL607 opfører sig på samme måde som REL606 under disse forhold. Men når de er belagt på tetrazolium arabinose (TA) agar, danner ^{Ara-og Ara +} celler henholdsvis røde og hvide kolonier. Denne metode til at skelne mellem de to forfædres E. coli-stammer og deres efterkommere er ret nyttig. Det kan bruges til at detektere krydskontaminering mellem LTEE-populationer. Det hjælper også med at måle egnetheden af en ^Ara-stamme eller befolkning i forhold til en ^{Ara +} en, når de konkurreres mod hinanden. Kondition måles ved at etablere en samkultur af modsat markerede konkurrenter og derefter overvåge, hvordan frekvenserne af røde og hvide kolonier (opnået ved at sprede fortyndinger af kulturen på TA-plader) ændrer sig mellem det tidspunkt, hvor konkurrenterne oprindeligt blandes, og efter en eller flere vækstcyklusser under de samme betingelser som LTEE. Repræsentationen af den mere egnede celletype vil stige under hver vækstcyklus.

Et andet kritisk træk ved LTEE er, at prøver af de udviklende populationer regelmæssigt arkiveres. Når de blandes med et kryoprotektant, såsom glycerol, kan E. coli-celler fryses og senere genoplives⁷. Som en del af LTEE-protokollen blandes hver 75. dag (hvilket svarer til ca. 500 generationer) en del af hver population, der ikke blev overført til en ny kolbe, med glycerol, opdelt mellem flere hætteglas og opbevares i en fryser. Denne frosne "fossile rekord" gjorde det muligt for forskere at udføre de første undersøgelser af LTEE, hvor de genoplivede de udviklede E. coli-populationer fra forskellige tidspunkter og konkurrerede dem mod forfædrenes stammer for at spore, hvor hurtigt konditionen steg¹. Fitnessudviklingen er blevet genmålt med jævne mellemrum, efterhånden som flere "lag" af den frosne "fossile rekord" er blevet bevaret. Den overordnede konklusion fra disse målinger er, at konditionen fortsætter med at forbedre sig i LTEE den dag i dag, selv efter så mange generationers evolution i det samme miljø ^8,9,10.

Hvad har gjort det muligt for LTEE at fortsætte så længe? Mange af de samme funktioner, der gjorde det muligt at stille og besvare dets oprindelige spørgsmål, har også fungeret som sikkerhedsforanstaltninger og fejlsikring mod uundgåelige forstyrrelser på grund af uheld, menneskelige fejl og verdensbegivenheder. Hver dag, når kulturerne overføres til frisk vækstmedium, skifter forskeren, der udfører overførslerne, mellem Ara⁻- og Ara⁺-populationer. Derefter, når populationerne er frosne, kan de belægges på selektiv agar og indikatoragar for at kontrollere, om nogen "nabo" populationer ved et uheld er blevet krydskontamineret eller blandet op (f.eks. Hvide kolonier er i en befolkning, der kun skal danne røde kolonier) eller forurenet med fremmede mikrober (f.eks. uventede kolonimorfologier eller celletætheder). I tilfælde af at en befolkning er blevet kompromitteret, kan dens stamfader genoplives fra fryseren og føres frem på sin plads. Ara-markørerne og det frosne arkiv tjener således to formål som både eksperimentelle ressourcer og sikkerhedsforanstaltninger.

Fordi dens historie er så velbevaret og let tilgængelig, er LTEE-prøver blevet undersøgt ved hjælp af teknologier, der ikke eksisterede, da eksperimentet begyndte. For eksempel er helgenomsekventering blevet brugt til at undersøge dynamikken i mutationer i LTEE-populationerne 11,12,13,14,15, og transkriptomics og ribosomal profilering er blevet brugt til at undersøge ændringer i genekspression ^16,17. Genetiske værktøjer er blevet brugt til at rekonstruere stammer, der adskiller sig ved enkelte mutationer eller kombinationer af flere udviklede mutationer for at forstå deres virkninger på fitness og forskellige fænotyper 18,19,20,21. Prøver fra den frosne "fossile rekord" genopfyldes let, så dele af eller hele kopier af eksperimentets historie kan sendes til andre laboratorier. LTEE-prøver findes nu på alle kontinenter undtagen Antarktis, og de studeres af forskere, der er yngre end selve eksperimentet. De robuste metoder i LTEE og udviklede E. coli-prøver og stammer fra dets historiske rekord har også tjent som udgangspunkt for evolutionseksperimenter, der undersøger andre spørgsmål og miljøer 22,23,24,25,26,27,28,29.

Figur 1: Oversigt over LTEE-procedurer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Her demonstrerer vi tre kerneprotokoller, der anvendes i E. coli Long-Term Evolution Experiment (figur 1). Vi beskriver: (1) hvordan man udfører de daglige overførsler, (2) hvordan man arkiverer populationsprøver og klonale isolater, og (3) hvordan man udfører og analyserer co-kultur konkurrenceanalyser for at måle fitnessforskelle. Vores håb er, at disse protokoller fremmer den fortsatte brug af LTEE-ressourcer og informerer designet af nye mikrobielle evolutionseksperimenter.

1. Daglige overførsler af LTEE-populationer

BEMÆRK: De tolv LTEE-populationer overføres dagligt ved podning af frisk medium med 1% af kulturerne fra den foregående dags kolber. Trinnene i denne proces er opsummeret i figur 1. De seks Ara-populationer startet fra stamme REL606 betegnes A-1 til ^A-6 , og de seks Ara⁺ populationer startet fra stamme REL607 betegnes A+1 til A+6. Streng overholdelse af aseptisk teknik og til en tidsplan og rækkefølge for overførsel af populationerne minimerer risikoen for forurening og andre forstyrrelser.

1. Desinficer overfladen, hvorpå LTEE-overførslerne skal udføres, ved at tørre den af med enten 70 % ethanol eller en 10 % blegemiddelopløsning. Tænd en bunsenbrænder for at skabe et lokalt træk og muliggøre flammende glasvarer.
   BEMÆRK: Brug laboratoriehandsker for at forhindre kontaminering. For sikkerheden omkring åben ild er det vigtigt kun at bruge handsker, der er lavet af et materiale som nitril, der ikke er brandfarligt.
2. Forbered tretten 50 ml borosilikatflasker af Erlenmeyer dækket med 20 ml borosilikat- eller polypropylenbægerglas, der er blevet vasket og steriliseret ved autoklavering. Kontroller kolberne for synligt snavs, og udskift dem, der ikke er helt rene.
3. Mærk seks kolber A-1 til A-6 ved hjælp af en rød markør og de andre seks kolber A + 1 til A + 6 ved hjælp af en sort markør. Mærk den sidste resterende kolbe, som vil være tom, med datoen i måneds-/dagformat og ugedagen.
4. Hver af de 13 kolber fyldes med 9,9 ml DM25-substrat med en steril 10 ml serologisk pipette. Der tændes ild til mundingen af hver kolbe, efter at bægerglasset, der tjener som låg, er fjernet, og efter at bægerglasset er blevet udskiftet. Tænd pipettens spids mellem påfyldning af hver kolbe.
   BEMÆRK: Instruktioner til fremstilling af DM25 er tilgængelige online³⁰. Hvis du bruger en serologisk plastpipette, skal du give afkald på at flamme dens spids eller begrænse tiden i flammen for at undgå at smelte plasten.
5. Den foregående dags LTEE-kolber fjernes fra rystekuvøsen.
6. Hver kolbe undersøges ved at holde den op mod lyset for at vurdere dens turbiditet og farve, kontrollere kolbens integritet og se efter tilstedeværelsen af fremmedlegemer.
   BEMÆRK: For det blotte øje vil alle Ara⁻ - og Ara⁺ -kulturer se lidt uklare ud sammenlignet med det blanke, bortset fra A−3, som vil være ~10 gange mere uklart end de andre på grund af vækst på citrat i mediet. Mange eksterne mikrobielle forurenende stoffer er også i stand til at vokse på citrat, så øget turbiditet i andre populationer end A-3 indikerer sandsynligvis forurening. Se afsnittet Repræsentative resultater for billeder af LTEE-kulturerne før en overførsel.
7. VALGFRIT: Bekræft, at hver LTEE-kultur har den forventede turbiditet ved at pipettere 1 ml af blindprøven og 1 ml af hver kultur i 1 cm plastkuvetter og foretage aflæsninger af optisk densitet ved 600 nm (OD600) ved hjælp af et spektrofotometer efter tømning af instrumentet.
   BEMÆRK: Dette ekstra trin kan være nyttigt for forskere, der er nye til at arbejde med LTEE og er usikre på at bedømme turbiditeten med øjet, samt til at dokumentere og undersøge mistænkte anomalier. Udtag først prøver til måling af OD600 fra den foregående dags kolber, når dagens normale overførsler til nye kolber er afsluttet (følgende trin) for at minimere risikoen for kontaminering af de cellepopulationer, der fortsat vil blive formeret, hvis OD600-værdierne er som forventet. Se afsnittet Repræsentative resultater for typiske OD600-værdier for LTEE-kulturer.
8. Ved hjælp af en P200-mikropipettor med steril filterspids overføres 100 μL kultur fra hver LTEE-kolbe til den tilsvarende kolbe indeholdende frisk DM25. Begynd med A−1, og overfør derefter A+1. Derefter fortsætter du med at skifte mellem − og + populationerne. For at holde styr på, hvilke kulturer der er blevet overført, skal du skifte kolber til venstre efter pipettering fra eller til dem.
   BEMÆRK: Den strenge rækkefølge af overførsler og veksling mellem Ara⁻ og Ara⁺ populationer hjælper med at forebygge og opdage krydskontaminering og sammenblandinger. Overhold streng aseptisk teknik: Brug en frisk pipettespids til hver overførsel, flamme kolbernes munding umiddelbart efter afdækning og inden genoptagelse, og tør mikropipettors tønde og ejektor ned med en fnugfri papirserviet fugtet med 70% ethanol mellem hver overførsel. Blegemiddel bør aldrig bruges til at desinficere mikropipettors, da selv spormængder kan dræbe kulturerne.
9. De nypodede kolber inkuberes ved 37 °C i 24 ± 1 time med en orbitalomrystning på 120 omdr./min. med en diameter på 1 tomme.
10. Kulturerne fra den foregående dag opbevares ved 4 °C. Opbevar disse backupkulturer i to dage. Kassér ældre kulturer, der blev gemt ved 4 °C tre dage før på dette tidspunkt.
    BEMÆRK: De foregående to dages kulturer giver to komplette sæt sikkerhedskopier, som du kan genstarte eksperimentet med, hvis det er nødvendigt, hvis der opstår problemer eller uheld, eller hvis der opdages forurening af den foregående dags kulturer inden overførsel (f.eks. Ulige farver eller uventede partikler).
11. Indtast klokkeslæt, dato, overførselsnummer, navn eller initialer på den forsker, der foretog overførslerne, uanset om kulturerne var okay eller ej, og andre relevante oplysninger i overførselslogbogen. Gå videre til trin 1.12-1.14, hvis en af følgende situationer opstår: 1) blindprøven fra den foregående dag er forurenet, 2) en kolbe eller dens låg er revnet eller knækket, 3) en kolbe indeholder fremmedlegemer, 4) en kolbe væltes eller tabes under overførsler, eller 5) der er nogen anden hændelse eller observation, der gør det tvivlsomt at fortsætte fra disse kolber.
12. Hvis der er problemer, ulykker eller mistanke om kontaminering med den foregående dags LTEE-kulturer, må du ikke overføre fra dem. Opbevar i stedet hele sættet af tolv kulturer ved 4 °C til senere undersøgelse og yderligere karakterisering.
13. Kolberne med de backupkulturer, der blev overført fra dagen før og opbevaret ved 4 °C, udtages. Placer dem på bordpladen for at varme op til stuetemperatur. Hver kolbe hvirvles forsigtigt rundt for at ophvirvle cellerne igen.
14. Overfør fra reservekolberne til det nye sæt kolber, der indeholder frisk substrat, og fortsæt forsøget normalt som beskrevet i trin 1.6-1.11. Notér i overførselsloggen, at backupkulturerne blev brugt, og registrer det samme overførselsnummer som dagen før.
    BEMÆRK: Selv hvis der kun konstateres et problem i en populations kolbe, skal du overføre alle tolv populationer fra backupkolberne, så antallet af generationer, der er gået i alle populationer, forbliver i fase. Hvis der konstateres kontaminering i backupkolberne, der opbevares ved 4 °C, skal de berørte LTEE-populationer genstartes fra frosne lagre ved hjælp af proceduren i trin 3.1-3.2 for populationsprøver. Overførselsnummeret for LTEE bør ikke øges før væksten af de første kulturer i DM25 efter genoplivning.

2. Arkivering af LTEE-populationerne

BEMÆRK: Prøver af LTEE-populationerne fryses for hver 75 overførsler. Populationerne vokser ~ 6 2/3 generationer hver dag efter den 100 gange overførselsfortynding, så denne periode svarer til ~ 500 generationer. Under arkivering belægges LTEE-populationerne også på forskellige typer agarmedier for at kontrollere for forurening. Eventuelt kan repræsentative kloner vælges fra disse plader og arkiveres på dette tidspunkt. Disse trin er opsummeret i figur 1.

1. Dagen før den planlagte nedfrysning eller et par dage før skal du forberede tre typer agarplader: Minimal glukose (MG), minimal arabinose (MA) og tetrazoliumarabinose (TA). Lav tolv plader af hver type agar plus et par ekstramateriale. Forbered også mindst 250 ml 0,85% (w / v) sterilt saltvand og 50 ml 80% (v / v) steril glycerol.
   BEMÆRK: Opskrifter til alle medier og løsninger er tilgængelige online³⁰. Dagen før LTEE når en generation, der er et multiplum af 500 for den almindelige arkiveringsplan, er den 74. dag siden den sidste frysning plus eventuelle dage, der blev tilføjet på grund af overførsler fra 4 °C backupkolber, da der blev opdaget eller mistanke om problemer^.
2. VALGFRIT: Hvis du arkiverer klonale isolater fra LTEE-populationerne, skal du forberede yderligere forsyninger: isolering af tre kloner fra hver population kræver 72 MG-plader, 80 ml 80% (v/v) glycerol og 370 ml DM1000.
3. Forbered et ekstra sæt på tolv kolber, når du udfører trin 1.2 i de daglige LTEE-overførsler dagen før den planlagte frysning. Mærk seks af de ekstra kolber xA−1 til xA−6 med en rød markør, og de andre seks xA+1 til xA+6 ved hjælp af en sort markør.
   BEMÆRK: "X" angiver, at det ekstra sæt kolber vil blive brugt til arkivering og adskiller dem fra det andet sæt kolber, der vil blive brugt til at fortsætte de daglige overførsler af LTEE parallelt.
4. Hver af de ekstra kolber, der skal bruges til arkivering, fyldes med 14,85 ml DM25 ved hjælp af en 25 ml serologisk pipette, når trin 1.4 i de daglige LTEE-overførsler udføres.
5. Fuldfør den normale LTEE-overførsel som beskrevet i trin 1.5−1.11. Gentag derefter instruktionerne for trin 1.8, men overfør denne gang 150 μL fra hver af den foregående dags LTEE-kulturer til de ekstra kolber på 14,85 ml frisk DM25, der skal bruges til arkivering.
   BEMÆRK: I dette og alle efterfølgende trin skal du undgå forurening og forveksling ved at følge disse retningslinjer. Begynd med population A-1, overfør derefter A + 1, og fortsæt derefter skiftevis - og + populationer. Tør mikropipettors tønde og ejektor af med en fnugfri papirserviet fugtet med 70% ethanol, når du skifter population. Skift kolber og reagensglas over i deres bakker eller stativer efter pipettering fra eller til dem for at holde styr på, hvilke overførsler der er afsluttet.
6. Sættet med tolv kolber til arkivering inkuberes ved 37 °C i 24 ± 1 time med en orbitalrystning på 120 omdr./min. sammen med de tolv LTEE-kulturer og blindprøven som beskrevet i trin 1.9.
7. Forberede forsyninger til plettering af LTEE-populationerne mindst en time før LTEE-overførslerne skal foretages på dagen for fastfrysningen.
   1. Vælg tolv MG-, tolv MA- og tolv TA-agarplader. Undersøg visuelt hver enkelt for at være sikker på, at den ikke har nogen åbenbar forurening.
   2. Mærk en af hver pladetype for hver af de tolv LTEE-populationer (A-1 til A+6).
      BEMÆRK: Når du mærker plader, skal du skrive på siderne af bunden af petriskålen. Dette er vigtigt for ikke at skjule kolonier, når man ønsker at undersøge eller fotografere dem nedefra agaren. Skriv ikke på lågene, da disse kan blandes sammen.
   3. Agarpladerne anbringes i en 37 °C inkubator i mindst 20 minutter for at varme dem, før de anvendes i trin 2.10.
   4. Forbered 24 reagensglas indeholdende 9,9 ml saltvand. Arranger dem i tolv sæt med to rør hver.
   5. Hvert af de to sæt af tolv reagensglas mærkes på samme måde som pladerne, og der tilføjes et "1" eller et "2" under LTEE-populationsidentifikatoren for at angive den rækkefølge, hvori de vil blive anvendt til fortynding af populationen.
8. Udfør trin 1.1-1.11 ved hjælp af kolberne, der fortsætter de daglige overførsler af LTEE som normalt. I trin 1.5 fjernes også de tolv kolber, der indeholder de ekstra kulturer til arkivering, fra rysteinkubatoren.
9. Der pipetteres 100 μL af kulturen fra hver af de tolv yderligere kolber til arkivering i det første reagensglas saltvand i parret for den pågældende LTEE-population. Vortex rørene med disse 100 gange fortyndinger grundigt. Derefter pipetteres 100 μL fra hver til det tilsvarende andet rør saltvand. Vortex de sidste 10.000 gange kulturfortyndinger grundigt.
10. Pipette 80 μL fra hvert af rørene, der indeholder en 10.000 gange kulturfortynding til de mærkede TA-, MG- og MA-plader for den population. Spred væsken ensartet over agaroverfladen ved hjælp af enten en steril spredestang eller sterile spredeperler, som foretrukket. Gentag, indtil alle tolv populationer er blevet belagt på alle tre typer medier.
11. Lad om nødvendigt pladerne tørre, indtil der ikke er nogen væske synlig på agaren. Pladerne anbringes på hovedet (med agarsiden opad) i en tyngdekraftskonvektionskuvøse indstillet til 37 °C.
    BEMÆRK: Inkubationsplader på hovedet forhindrer agaren i at tørre ud og forhindrer kondens i at dryppe ned på agaroverfladen. Bevægelse af celler i væske på agaroverfladen under inkubation kan smøre kolonier og give forkerte kolonitællinger.
12. Der tilsættes 3 ml steril 80% (v/v) glycerol til hver af de tolv ekstra kolber, der er øremærket til arkivering. Bland grundigt ved hvirvlende og forsigtigt hvirvelstrøm.
13. Blandingen fordeles fra hver kolbe til sterile kryovialer, der er mærket med en entydig identifikator for prøven, den LTEE-population, som prøven tilhører, den generation, hvor den blev frosset, at det er en blandet (populations)prøve, og datoen. Der pipetteres 6 ml i ét stort hætteglas og 1,25 ml i hvert af seks små hætteglas.
    BEMÆRK: Det store hætteglas er arbejdsmaterialet. Et lille hætteglas er en backup, hvis arbejdsmaterialet er opbrugt eller bliver forurenet. De andre fem små hætteglas er kopier, der kan sendes til andre laboratorier.
14. De fyldte hætteglas fryses ned ved -80 °C.
15. Undersøg og dokumentér koloniernes vækst og morfologier på TA-, MG- og MA-pladerne efter 24 timer og 48 timers inkubation.
    BEMÆRK: Se afsnittet Repræsentative resultater for billeder og beskrivelser af kolonier dannet af REL606- og REL607-forfædrene og hver af de tolv LTEE-populationer, da de blev belagt med 76.000 generationer.
16. VALGFRIT: Udfør følgende trin ved arkivering af klonale isolater.
    1. Der vælges tre klonale isolater (kolonier) for hver LTEE-population fra MG-pladerne, hver enkelt anbringes separat på en ny MG-plade, og disse plader inkuberes i 16-24 timer ved 37 °C.
       BEMÆRK: Hvis kolonier med forskellige morfologier er til stede, er standardpraksis i LTEE at prøve for maksimal mangfoldighed ved først at vælge den mest almindelige type og derefter vælge yderligere kolonier fra minoritetstyper. Man kan også bruge en tilfældig prøveudtagningsstrategi ved at markere prikker på undersiden af bunden af petriskålen, før man spreder celler og derefter plukker den isolerede koloni nærmest hvert mærke efter vækst.
    2. Den næste dag skal du stribe en repræsentativ koloni fra hver plade på en ny MG-plade og inkubere disse plader i 16-24 timer ved 37 ° C.
    3. Den følgende dag podes en isoleret koloni fra hver MG-plade i en kolbe indeholdende 10 ml frisk DM1000. Fyld også en ekstra kolbe med 10 ml DM1000 for at tjene som en ikke-inokuleret blindprøve til test for mediekontaminering.
    4. Kolberne inkuberes ved 37 °C i 16-24 timer med orbitalomrystning ved 120 o/min over en diameter på 1 tomme.
    5. Efter inkubation tilsættes 2 ml steril 80% (v/v) glycerol til hver kolbe og hvirvles rundt for at blande.
    6. Der fordeles 1,25 ml alikvoter fra hver kolbe i små, sterile hætteglas mærket med en unik identifikator for hver klon, dens LTEE-population og oprindelsesgeneration, at det er en klonprøve, og datoen.
    7. De fyldte hætteglas fryses ned ved -80 °C.

3. Konkurrencedygtige fitnessanalyser

BEMÆRK: I LTEE kvantificeres reproduktionsegnethed i form af det relative antal fordoblinger, som forskellige bakterier opnår over en eller flere 24 timers dyrkningscyklusser under de samme betingelser som de daglige overførsler. Specifikt er den relative egnethed hos en konkurrent til en anden forholdet mellem deres realiserede fordoblingshastigheder, når de konkurrerer head-to-head i en co-kultur. Hver konkurrent i et par kan være en fuld population eller et klonalt isolat, der tidligere blev arkiveret som en del af LTEE's frosne "fossile rekord". Alternativt kan en eller begge konkurrenter være en klon, der er blevet genetisk modificeret for at tilføje eller fjerne specifikke mutationer for at teste deres virkninger. De to konkurrenter skal have modsatte Ara⁺/Ara⁻ tilstande, fordi denne genetiske markør bruges til at differentiere dem under dette assay. Den overordnede arbejdsgang for et konkurrenceassay er vist i figur 2. Varigheden af co-kultureringsfasen kan forlænges fra en til tre (eller flere) dage for at forbedre præcisionen af fitnessestimater, når der testes for forskelle mellem konkurrenter, der er næsten jævnt matchede. Se Disussion for andre kritiske overvejelser og mulige ændringer af denne protokol.

Figur 2: Flowdiagram over konkurrenceanalyse. Den fulde procedure for en en-dags konkurrenceanalyse vises. Tredagesproceduren fortsætter med den alternative vej på dag 1 og dag 2 indtil plating på dag 3 på samme måde som på billedet for dag 1 i endagskonkurrencen. Klik her for at se en større version af denne figur.

1. Forbered forsyninger
   1. Beslut, hvor mange LTEE-stammer og/eller populationer der skal bruges, og hvor mange replikate konkurrenceassays der skal udføres for hvert par konkurrenter. Forbered de nødvendige forsyninger som beskrevet i de følgende trin.
      BEMÆRK: Opskrifter til alle medier og løsninger er tilgængelige online³⁰. De kolber og reagensglas, der kræves til alle dage af et konkurrenceforsøg, kan fyldes på forhånd eller efter behov på de dage, de skal bruges. Hvis kolber og reagensglas er fyldt på forhånd, skal de opbevares ved stuetemperatur i mørke for at minimere fordampning. TA-plader skal forberedes mindst to dage før, de skal bruges, så de kan tørre nok efter hældning til at muliggøre spredning af kulturfortyndinger. Forbered altid et par ekstra kolber, reagensglas og TA-plader, så et eksperiment kan fortsætte, hvis der er pipetteringsfejl, forurenede plader eller andre mindre uheld.
   2. Til genoplivningsdagen (dag -2) fyldes en steril 50 ml Erlenmeyerkolbe dækket med et 20 ml bægerglas med 9,9 ml enten DM1000 eller Lysogeny Broth (LB) pr. stamme eller population af E. coli , der vil blive brugt som konkurrent. En kolbe mere fyldes med 9,9 ml af samme substrat for at tjene som en ikke-inokuleret blindprøve.
   3. Til prækonditioneringsdagen (dag -1) fyldes et reagensglas med 9,9 ml 0,85 % (w/v) sterilt saltvand pr. konkurrent, to kolber med 9,9 ml DM25 pr. replikat assay mellem et par konkurrenter og endnu en kolbe med 9,9 ml DM25 til en blindprøve.
   4. For den dag, konkurrencen begynder (dag 0), fyldes en kolbe med 9,9 ml DM25, et reagensglas fyldes med 9,9 ml 0,85% (w/v) sterilt saltvand, og der tilberedes en TA-plade pr. konkurrenceanalysereplikate. En kolbe mere fyldes med 9,9 ml DM25 for at tjene som blindprøve.
   5. ALTERNATIV: For hver dag i en flerdages konkurrence efter den første fyldes en kolbe med 9,9 ml DM25 pr. konkurrencereplikat og fyldes endnu en kolbe med 9,9 ml DM25 for en blindprøve.
   6. På konkurrencens sidste dag (f.eks . dag 1 eller dag 3) fyldes to reagensglas med 9,9 ml 0,85 % (w/v) sterilt saltvand, og der tilberedes en TA-plade pr. konkurrencereplikat.
2. Dag −2: Genopliv konkurrenterne separat i DM1000 eller LB
   1. For hver af konkurrenterne mærkes en kolbe fyldt med 9,9 ml enten DM1000 eller LB. En ekstra kolbe fyldt med 9,9 ml fra samme batch af substrat mærkes som en ikke-inokuleret blindprøve til test for kontaminering.
      BEMÆRK: Frosne lagre genoplives i LB eller DM1000 for mere ensartet og forudsigelig genopretning af kryopræserverede celler. Den glycerol, der anvendes som kryoprotektant, kan metaboliseres af E. coli, hvilket vil føre til højere celletætheder end forventet, hvis prøver genoplives i DM25. LB og DM1000 understøtter vækst til så høje celletætheder, at denne komplikation bliver ubetydelig.
   2. Kryoialerne med de frosne lagre af de konkurrerende stammer tages ud af fryseren til -80 °C. Opbevar hætteglassene afkølet i en isspand, mens du bruger dem.
   3. Efter hver frossen bestand er optøet, hvirvel det grundigt for at resuspendere E. coli-cellerne. Hvis en klon genoplives, podes kolben med frisk substrat med 12 μL af den frosne stamme. Hvis en population genoplives, podes kolben med 120 μL af den frosne bestand.
      BEMÆRK: 120 μL volumen af det frosne lager anvendes til populationer, således at antallet af celler, der genoplives, er omtrent det samme som den daglige flaskehals, når 1% af LTEE-populationen overføres til en ny kolbe. Optøning og hvirvelstrømsdannelse af frosne bestande flere gange kan stresse celler og reducere bestandenes levedygtighed over tid. Hvis en given LTEE-population eller klon skal bruges i konkurrencer flere gange, er det god praksis at genvokse og fryse flere kopier af bestanden, så ingen optøes og genfryses mange gange.
   4. Revivalkolberne og blindprøven inkuberes ved 37 °C natten over (16-24 timer) med en orbitalomrystning på 120 omdr./min. over en diameter på 1 tomme.
3. Dag −1: Forhåndsbetingelse for deltagere separat i DM25
   1. For hver konkurrent skal du mærke et reagensglas fyldt med 9,9 ml saltvand. For hvert replikat konkurrenceassay mellem et par konkurrenter mærkes to 50 ml kolber fyldt med 9,9 ml DM25, hver med replikationsnummeret og navnet på en af konkurrenterne. Mærk en ekstra kolbe fyldt med 9,9 ml DM25 for at tjene som blindprøve.
   2. Tag kolberne indeholdende kulturerne fra genoplivede konkurrenter ud af inkubatoren. Undersøg deres turbiditet med øjet for at bekræfte, at de voksede, og at der ikke er nogen åbenbar forurening.
   3. 100 μL fra hver kolbe pipetteres ind i reagensglasset med saltvand for den pågældende konkurrent.
      BEMÆRK: Dette trin fortynder kulturen 100 gange, hvilket er nødvendigt, fordi tætheden af celler er meget højere i LB og DM1000 end i DM25-miljøet, der anvendes i LTEE (se repræsentative resultater).
   4. Hvert fortyndingsrør rystes grundigt, umiddelbart før 100 μL fra den fortyndede kultur pipetteres til en kolbe med frisk DM25. To af disse forkonditioneringskolber podes for hvert replikat assay, en for hver af konkurrenterne.
   5. Forkonditioneringskolberne og blindprøven inkuberes ved 37 °C i 24 ± 1 time med en orbitalomrystning på 120 omdr./min. med en diameter på 1 tomme.
4. Dag 0: Start konkurrencen med at blande konkurrenter og plade til indledende tællinger
   1. For hver konkurrenceanalysereplikat mærkes en kolbe fyldt med 9,9 ml DM25 og et reagensglas fyldt med 9,9 ml saltvand. Mærk kolberne og rørene på en måde, der entydigt identificerer hvert par konkurrenter og replikationsnummeret på konkurrenceanalysen. Mærk en ekstra kolbe fyldt med 9,9 ml DM25 for at tjene som blindprøve.
   2. Tag forkonditioneringskolberne ud af inkubatoren. Undersøg deres turbiditet med øjet for at bekræfte, at de voksede, og at der ikke er nogen åbenbar forurening.
   3. Overfør 50 μL af Ara^−- konkurrenten til den første replikate konkurrencekolbe fyldt med frisk DM25. Overfør straks 50 μL af Ara⁺ konkurrenten til den samme konkurrencekolbe og bland den ved forsigtigt at dreje rundt.
   4. Gentag trin 3.4.3 for alle replikater af alle par konkurrenter.
      BEMÆRK: Konkurrencekolberne har nu en samlet 100 gange fortynding af E. coli-kulturer dyrket i DM25, de samme tilstandsceller i LTEE-oplevelsen efter hver daglig overførsel. Rækkefølgen for udførelse af overførsler og blanding er vigtig. Tilsæt begge konkurrenter til hver kolbe straks efter hinanden, så ingen af dem får et forspring, der vokser i det friske medium. For eksempel må du ikke tilføje Ara-kulturerne til alle konkurrencekolber og derefter gå tilbage og tilføje alle Ara^+-stammerne.
   5. Der pipetteres 100 μL fra hver nypodet konkurrencekolbe ind i reagensglasset med saltvand, der er mærket til den pågældende konkurrenceanalyse, replikeres, således at hvert af disse rør indeholder en samlet 10.000 gange fortynding af de prækonditionerede DM25-kulturer, der blev kombineret.
   6. Placer konkurrencekolberne og emnet i rysteinkubatoren. Konkurrencekolberne inkuberes ved 37 °C i 24 ± 1 time med orbitalrystelser på 120 omdr./min. over en diameter på 1 tomme.
   7. Samme dag, umiddelbart efter at konkurrencekolberne er anbragt i inkubatoren, hvirvirvles hvert reagensglas fra trin 3.4.5 grundigt og spredes 80 μL af disse 10.000 gange fortyndinger på TA-plader som beskrevet i trin 2.10. Mærk siden af bunden af hver plade med det par stammer, der blev blandet, replikationsnummeret og "Dag 0" for at angive, at det vil blive brugt til at bestemme den oprindelige repræsentation af hver konkurrent.
   8. TA-pladerne inkuberes på hovedet i en tyngdekraftskonvektionsinkubator ved 37 °C, indtil kolonierne hos både Ara⁻- og Ara⁺-konkurrenterne er synlige og kan skelnes. Generelt sker dette inden for 16-24 timer, men det kan tage længere tid for nogle udviklede stammer. Tæl antallet af Ara⁻ (rød) og Ara⁺ (hvid) kolonier på hver plade ogregistrer resultaterne.
      BEMÆRK: Forskellene mellem farverne på Ara^- og Ara⁺ kolonierne på TA-plader bliver mindre tydelige over tid, selv når pladerne opbevares ved 4 °C, så de skal tælles så hurtigt som muligt, når de er fjernet fra inkubatoren. Billeder af TA-plader, der viser det typiske udseende af kolonier dannet af Ara^- , og Ara⁺ -celler, er inkluderet i de repræsentative resultater. Dette afsnit har også billeder af almindelige "edge case" kolonier (f.eks. overlapning eller udvækst af forskellige kolonityper) og forklarer, hvordan man tæller dem. Hvis væksthastighederne og morfologierne for kolonier dannet på TA-plader af nogen af konkurrenterne ikke tidligere er blevet karakteriseret, spredes 80 μL af en 10.000 gange fortynding i saltvand fra forkonditioneringskolberne på dag 0, når konkurrenterne stadig er adskilt fra hinanden. Derefter undersøges kolonierne på disse kontrolplader efter inkubation ved 37 °C i 16-24 timer eller længere.
5. ALTERNATIV: Dag 1 og 2: Fortsæt tredages konkurrence
   1. For hver konkurrenceanalysereplikat mærkes en kolbe fyldt med 9,9 ml DM25. Mærk kolberne på en måde, der entydigt identificerer hvert par konkurrenter, replikationsnummeret og dagen for konkurrenceanalysen. Mærk en ekstra kolbe fyldt med 9,9 ml DM25 for at tjene som blindprøve.
   2. Tag konkurrencekolberne fra den foregående dag ud af inkubatoren. Undersøg deres turbiditet med øjet for at verificere forventet vækst og opdage kontaminering.
   3. Der overføres 100 μL fra hver konkurrencekolbe til den tilsvarende kolbe frisk substrat til næste konkurrencedag.
   4. Placer de nye konkurrencekolber og emnet i rysteinkubatoren. De inkuberes ved 37 °C i 24 ± 1 time med orbitalrystelser på 120 omdr./min. over en diameter på 1 tomme.
   5. Gentag trin 3.5.1-3.5.4 på dag 2 i konkurrencen, før du fortsætter.
6. Dag 1 eller 3: Afslut konkurrence og plade til endelige tællinger
   1. For hver konkurrencekolbe fremstilles to reagensglas fyldt med 9,9 ml saltvand. Mærk dem på en måde, der entydigt identificerer hvert par konkurrenter, replikationsnummeret, og om de er til den første eller anden fortynding.
   2. Tag konkurrencekolberne ud af inkubatoren. Undersøg deres turbiditet med øjet for at opdage, at de voksede, og at der ikke var nogen åbenlys forurening.
   3. Der pipetteres 100 μL fra hver konkurrencekolbe ind i det første rør saltvand for denne replikation. De resulterende rør indeholder 100 gange fortyndinger af DM25-kulturerne.
   4. Hvert 100 gange fortyndingsrør hvirvles for at blande det grundigt, og der pipetteres 100 μL til det andet rør saltvand for at replikere. De resulterende rør indeholder 10.000 gange fortyndinger af DM25-kulturerne.
   5. Hvert reagensglas indeholder en 10.000 gange fortynding grundigt og fordeler 80 μL af det på en TA-plade som beskrevet i trin 2.10. Mærk siden af bunden af hver plade med det par stammer, der blev blandet, replikationsnummeret og "Dag 1" for en endagskonkurrence eller "Dag 3" for en tre-dages konkurrence for at angive, at det vil blive brugt til at bestemme den endelige repræsentation af hver konkurrent.
   6. Der inkuberes ^TA-plader ved 37 °C, og Ara⁺ -kolonierne tælles efter vækst som beskrevet i trin 3.4.8.
      BEMÆRK: Hold styr på det replikerede antal af hver konkurrenceanalyse gennem alle overførsler og pletteringstrin. Forvirring af, hvilke endelige og indledende tællinger der svarer mellem forskellige replikate assays - selv når de samme to konkurrenter blev blandet i hver enkelt - vil resultere i forkerte fitnessestimater.
7. Beregning og plot fitness
   1. Hvis du bruger Excel til at beregne og plotte relativ kondition, skal du downloade XLS-regnearket (supplerende fil 1). Hvis du bruger R, skal du installere fitnessR-pakke³¹ og downloade skabelonen CSV (kommaseparerede værdier) (supplerende fil 2) eller generere en ny kopi af denne fil ved at følge anvisningerne i vignetten.
   2. Indtast en "overførselsfortynding" på 100 for de konkurrenceanalyser, der udføres i den udpegede celle eller kolonne i den downloadede fil. Angiv det samlede antal daglige vækstcyklusser, hvor konkurrenterne blev meddyrket som "antallet af overførsler" (f.eks. 3 for en tre-dages konkurrence).
   3. Indtast navnene på hvert par konkurrenter i de udpegede celler eller kolonner med referencestammen som "konkurrent1" og teststammen eller populationen som "konkurrent2".
   4. For hver konkurrenceanalysereplikat skal du indtaste de respektive indledende og endelige kolonitællinger i de udpegede kolonner i den downloadede fil.
   5. Hvis du bruger Excel-regnearket, viser det nu den gennemsnitlige relative fitnessværdi og 95% konfidensgrænser for dette estimat. Kopiér resultaterne for forskellige kombinationer af konkurrenter til et andet ark, og opret et diagram, der opsummerer resultaterne. Hvis du bruger R til at analysere dataene, skal du følge anvisningerne i vignetten for fitnessR-pakken for at udføre disse beregninger, udskrive en CSV-fil med de beregnede værdier og plotte resultaterne.

LTEE-kulturers udseende og turbiditet
På grund af den lave glukosekoncentration i DM25 er turbiditeten hos fuldvoksne LTEE-populationer kun lige synlig i elleve af de tolv kolber. Ved undersøgelse af LTEE-kulturerne med henblik på normal vækst og tegn på kontaminering (trin 1.6) skal hver kolbe med en LTEE-population sammenlignes side om side med blindprøven (figur 3A). Undtagelsen er population A-3, som udviklede sig til at bruge citrat som en ekstra kulstof- og energikilde og derfor når en højere celletæthed³². Uklarheden af DM25-kulturer i REL606- og REL607-forfædrestammerne svarer til den hos en typisk udviklet population (figur 3B). LTEE-stammer og populationer vokser til en højere densitet i DM1000 på grund af den højere koncentration af glukose og en meget højere densitet i LB (figur 3B). Tætheden af DM25-kulturer i A-3 LTEE-populationen er mellemliggende mellem tætheden af kulturer af REL606 i DM25 og DM1000 (figur 3C).

Figur 3: LTEE-kulturers udseende. (A) Kolber, der indeholder de tolv LTEE-populationer efter 24 timers vækst i DM25 den dag, hvor eksperimentet nåede 76.253 1/3 generation, er afbildet sammen med blindprøven. (B) Kolber, der indeholder kulturer af REL606- og REL607-forfædrene, der er dyrket i 24 timer i DM25, DM1000 og LB, er afbildet sammen med medieemner. (C) Zoomet ind på billeder af de samme kolber side om side, der viser, hvordan turbiditeten af A-3-populationskolben i DM25 er sammenlignet med REL606-forfaderen i DM25 og DM1000. Klik her for at se en større version af denne figur.

Spektrofotometeraflæsninger af de optiske tætheder ved 600 nm (OD600) af kulturer dyrket i DM25 (trin 1.7) svarer til disse visuelle observationer for både LTEE-populationerne (figur 4A) og deres forfædre (figur 4B). Disse aflæsninger kan bruges til kvantitativt at sammenligne og dokumentere vækst, når der er mistanke om forurening eller en fejl. Til målinger af LTEE-populationerne mellem 76.000 og 76.500 generationer fandt vi, at OD600 af A-3, befolkningen, der udviklede sig til at vokse på citrat, var 0,223 i gennemsnit (0,218-0,227, 95% konfidensinterval). OD600 af de øvrige elleve populationer var 0,0252 i gennemsnit (0,0239-0,0265, 95% konfidensinterval). Der var en lille, men signifikant variation i OD600-aflæsninger blandt de elleve normalpopulationer (F 10,88 = 5,1035, p = _7,5×^10-6). LTEE-populationerne når stationær fase efter ca. 5-6 timers inkubation. Hvis de overføres om morgenen, vil væksten være synlig midt på eftermiddagen samme dag. Mange arter af mikrober er i stand til at vokse aerob på citrat. Derfor er øget turbiditet i andre populationer end A-3 sandsynligvis et tegn på forurening udefra.

Figur 4: Uklarhed af LTEE-kulturer. (A) Optisk densitet ved 600 nm (OD600) af de tolv LTEE-populationer efter 24 timers vækstcyklus på tre forskellige dage mellem 76.000 og 76.500 generationer af eksperimentet. OD600-værdierne for tre 1-ml alikvoter på hver af de tre forskellige dage afbildes som punkter. Den gennemsnitlige OD600-værdi af tre forskellige delprøver af blindprøven fra samme dag blev trukket fra disse værdier. Fyldte søjler viser gennemsnit. Fejlbjælker er 95% konfidensgrænser. (B) OD600 af kulturer af REL606 og REL607 forfædre i DM25, DM1000 og LB. OD600-værdierne for tre 1-ml alikvoter på hver af tre forskellige dage i to separate kulturer for hver tilstand og stamme er plottet som punkter. Den gennemsnitlige OD600-værdi af tre forskellige delprøver af blindprøven fra samme dag blev trukket fra disse værdier. Udfyldte søjler viser gennemsnit, og fejlbjælker er 95% konfidensgrænser. Grå skraverede områder mellem panelerne viser, hvordan OD600-aksen skaleres mellem DM25-panelet og DM1000- og LB-panelerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Vækst og morfologi af LTEE kolonier
Ved kontrol af populationerne for kontaminering ved at belægge dem på forskellige medier (trin 2.15) danner REL606- og REL607-forfædrene og alle udviklede populationer hvide kolonier med gennemskinnelige og noget uregelmæssige kanter på minimale glukose (MG) agarplader (figur 5A). Sammensætningen af MG-agar er den samme som for DM25, der anvendes i de daglige LTEE-overførsler, bortset fra med en højere koncentration af glukose, så de udviklede LTEE-populationer danner ofte større kolonier på MG end forfædrene. På grund af den højere celletæthed i DM25 vil A-3-populationen have flere gange flere kolonier, hvis der er belagt samme volumen for den som for de andre populationer, og dette kan begrænse koloniernes størrelse. De mest almindelige typer forurenende mikrober danner skarpe hvide, uigennemsigtige og perfekt cirkulære kolonier på MG.

På minimal arabinose (MA) agar danner REL607-forfaderen og ^{Ara +} -populationerne typisk alle let gennemskinnelige hvide kolonier. Dette typiske vækstmønster har varet ved for ^Ara + -populationerne gennem 76.000 generationer, undtagen A + 6, som har udviklet en defekt i væksten på arabinose og ikke længere danner kolonier på MA (figur 5B). Der er ingen selektion til at opretholde væksten på arabinose under LTEE-overførslerne i DM25, så andre ^{Ara +} -populationer kan også i sidste ende stoppe med at danne kolonier på MA agarplader, efterhånden som eksperimentet fortsætter. Med undtagelse af A-3 danner Ara-populationerne ikke kolonier på ^MA-agar , selvom nøje undersøgelse kan afsløre mikrokolonier på grund af spornæringsstoffer i agaren. A-3-populationen danner adskillige små kolonier på MA, da disse celler kan vokse på citratet, der også er til stede i dette medium. Forurenende kolonier på MA er sjældne.

Figur 5: Plettering af LTEE-populationer for at detektere forurening. Fortyndinger af REL606 og REL607 forfædrene og de tolv LTEE populationer på dagen, hvor eksperimentet nåede 76.026 2/3 generationer blev belagt på (A) MG, (B) MA og (C) TA agarplader og fotograferet efter 24 timer og 48 timer. De samme fortyndinger blev foretaget for alle kulturer, men halvt så meget volumen blev belagt for forfædrene, som det er beskrevet i protokollen for LTEE-populationerne, for at tage noget højde for deres højere celletætheder. Klik her for at se en større version af denne figur.

På tetrazolium arabinose (TA) agar forventes REL606-forfaderen og alle Ara-populationer at danne røde kolonier, mens REL607-forfaderen og alle Ara⁺-populationer generelt bør danne kolonier, der er hvide (som kan omfatte lyserøde eller ferskenfarver) (figur 5C). LTEE-forfædrene danner robuste kolonier, som let kan identificeres som Ara⁻ og Ara⁺ på TA-agar inden for 16-24 timer. Oprindeligt kunne denne forskel bruges til at detektere krydskontaminering mellem Ara⁻ og Ara⁺ populationer. TA-agar har imidlertid en mere kompleks næringsstofsammensætning end det kemisk definerede DM25-medium, der anvendes i de daglige overførsler, og der har ikke været et evolutionært pres for E. coli i LTEE for at opretholde en evne til robust vækst under disse forhold. Derfor udviser nogle udviklede LTEE-populationer nu dårlig vækst på TA-plader, hvilket tager 48 timer at danne kolonier eller slet ikke pålideligt vokse. Farverne og morfologierne af kolonier dannet på TA af de udviklede LTEE-populationer har også ændret sig i forhold til forfædrene og divergeret fra hinanden. Tilstedeværelsen af nogle få afvigende kolonier er ikke altid en indikation af forurening. Spontane mutationer kan forekomme, der skifter Ara-markørtilstanden for LTEE-stammer, især fra Ara⁺ til ^Ara-på grund af den højere sandsynlighed for funktionstab-mutationer, der påvirker arabinoseudnyttelsen versus tilbageførselsmutationer, der gendanner araA-aktivitet. Mutationer, der skifter Ara-markørtilstande, er mere almindelige i populationer, der har udviklet hypermutation (A-1, A-2, A-3, A-4, A + 3 og A + 6)¹³. På TA-agar danner forurenende mikrober af andre arter ofte (men ikke altid) små, perfekt cirkulære kolonier med røde centre omkranset af forskellige hvide grænser, der er ulig dem, der dannes af nogen LTEE-stammer eller populationer.

Resultater af samkulturkonkurrencen
Konkurrencer mellem alle Ara−- og Ara⁺-par af de to LTEE-forfædre (henholdsvis REL606 og REL607) og A−5- og A+5-populationsprøverne arkiveret ved 20.000 generationer (henholdsvis REL8597 og REL8604) viser, hvordan kolonier med forskellige ^{Ara-markørtilstande} kan differentieres og tælles med på TA-agar (trin 3.4.8 og 3.6.6) (figur 6). Kolonier blev talt for seks replikate kolber for hvert par konkurrenter før og efter en-dags og tre-dages assays, der begyndte med genoplivning i DM1000 (tabel 1). Det samlede antal kolonier, der er observeret for den samme fortynding og volumenbelagte størrelse, varierer med, hvilke konkurrenter der blev blandet, fordi kulturer af udviklede LTEE-populationer når lavere celletætheder end kulturer af forfædrestammerne i DM25. Denne forskel er en konsekvens af udviklingen af øget cellestørrelse, som forekom i alle LTEE-populationer i løbet af de første par tusinde generationer af eksperimentet ^8,33.

Figur 6: Konkurrenceanalyser belagt på TA-agarplader. Eksempler på TA-agarplader fra konkurrenceanalyser. REL606 og REL607 er henholdsvis Ara⁻ og Ara⁺ forfædrene til LTEE. REL8597 og REL8604 er henholdsvis 20.000 generation A-5 og A+5 populationer fra den frosne "fossile rekord" af LTEE. TA-plader svarende til et replikat assay mellem hvert par stammer vises for dag 0, dag 1 og dag 3 i konkurrencen. Pladerne blev fotograferet efter 24 timers vækst ved 37 °C. Celler af REL606 og REL8597 konkurrenter er Ara⁻ og danner røde kolonier. Celler af REL607 og REL8604 konkurrenter er ^{Ara +} og danner hvide kolonier. Klik her for at se en større version af denne figur.

De fleste kolonier på en typisk konkurrence TA-plade vil være godt adskilt eller overlappe hinanden på måder, hvor det er let at tælle, hvor mange oprindeligt cirkulære kolonier af forskellige typer voksede sammen (figur 7A). Der kan dog opstå nogle situationer, hvor det ikke er indlysende, hvordan man tæller en atypisk koloni eller vækst, der er en blanding af de to farver. For det første, når en hvid Ara+ koloni og en rød Ara⁺ koloni overlapper hinanden, har Ara⁺ kolonien en tendens til at vokse og omslutte Ara⁻ kolonien. I denne situation skal man tælle en lille rød plet eller gennemskinneligt "hul" i den større Ara⁺ koloni som en Ara⁻ koloni (figur 7B). For det andet vil spontane Ara⁺ mutanter lejlighedsvis opstå i Ara⁻ kolonier. Disse mutanter fremstår typisk som hvide sektorer (papiller), der spredes hurtigere ud af det indre af en rød koloni, fordi de vokser hurtigere, når de får adgang til arabinose som et ekstra næringsstof (figur 7C). Disse hvide sektorkolonier tælles som en ^Ara-koloni og ingen Ara⁺ kolonier. Denne situation bliver mere almindelig, hvis pladerne inkuberes i 48 timer eller længere. For det tredje observeres undertiden gennemskinnelige lyserøde kolonier (figur 7D). Disse er dannet af ^{Ara-konkurrenten}. Endelig vokser et lille antal cirkulære kolonier med interiører, der er en lidt anden rød nuance, undertiden på TA-plader, når de er forurenet af nogle få eksterne mikrobielle celler under fremstilling af agar eller ved spredning af kulturfortyndinger på deres overflader (figur 7E). Disse forurenende kolonier bør ikke tælles. Hvis der er mistanke om kontaminering af en konkurrencekultur, fordi der er mange atypiske kolonier på nogen af dens TA-plader, bør denne replikation udelukkes.

Figur 7: Randtilfælde, der opstår ved tælling af Ara−- og Ara⁺-kolonier på ^TA-agar. I hvert panel er nogle Ara^−- og Ara⁺-kolonier, der skal tælles, markeret med henholdsvis røde og sorte pile. Kolonier, der ikke skal tælles, er angivet med stiplede pile, der svarer til den type, de ser ud til at være. Alle fotos blev taget efter 24 timers inkubation undtagen i panel C. (A) Eksempler på normale Ara⁻- og Ara⁺-kolonier. (B) Eksempler på Ara⁺ kolonier, der vokser over nærliggende ^Ara-kolonier, herunder en, der kun lige er synlig som et gennemsigtigt hul i ydersiden af den hvide koloni. Tæl hvert af disse tilfælde som to kolonier, en af hver type. (C) Eksempler på ^Ara-kolonier, der giver anledning til Ara⁺ mutantsektorer. Tæl hvert tilfælde som kun en enkelt ^Ara-koloni. Den hvide sektor (papilla), der opstår, skyldes en ^{Ara +} mutant, der opstår i kolonien. Det samme kolonifelt er vist efter 24 timer, 48 timer og 72 timers vækst. D) Eksempel på en gennemsigtig lyserød koloni. Tæl det som Ara⁻. E) Eksempler på kolonier dannet ved ekstern kontaminering med en mikrobe, der ikke er E. coli. Disse er røde, men mindre og perfekt cirkulære med en tydelig hvid grænse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Analyse af kolonitællingerne fra disse konkurrencer ved hjælp af Excel-regnearket (supplerende fil 1) eller ved at køre fitnessR-pakkefunktionerne i R på kolonitællinger, der er indtastet i CSV-skabelonen (supplerende fil 2), viser, at de to forfædre ikke kan skelnes med hensyn til deres egnethed inden for analysens præcision, at både 20.000-generationerne A-5- og A+5-populationer er betydeligt mere egnede end forfædrene, og at ingen af de udviklede populationer er signifikant mere egnede end den anden (Welchs t-tests, p > 0,05) (figur 8). Præcisionen af det relative konditionsestimat forbedres i tre-dages konkurrencerne i forhold til endagskonkurrencerne for et af de tæt matchede par (REL606 vs. REL607). Præcisionen af disse målinger kan øges yderligere ved at gennemføre længere konkurrencer med flere vækstcyklusser, hvis det ønskes. Resultaterne fra flerdageskonkurrencer er imidlertid ikke informative, når den ene konkurrent bliver så rigelig i forhold til den anden efter de ekstra konkurrencedage, at forholdet mellem de to stammer ikke kan bestemmes nøjagtigt, fordi der er meget få eller ingen kolonier af den mindre egnede type at tælle. Dette er tilfældet for forfædrenes tre-dages konkurrencer mod de udviklede 20.000 generationspopulationer (REL606 vs. REL8604 og REL607 vs. REL8597) (figur 6 og tabel 1).

Tabel 1: Kolonitællinger fra konkurrencedygtige fitnessanalyser. En-dags og tre-dages konkurrenceanalyser med seks replikater blev udført for alle parvise kombinationer af to ^Ara-og de to Ara⁺ -konkurrenter. REL606 og REL607 er henholdsvis Ara⁻ og Ara⁺ forfædrene til LTEE. REL8597 og REL8604 er henholdsvis 20.000 generationer A-5 og A + 5 populationer fra den frosne "fossile rekord" af LTEE. Klik her for at downloade denne tabel.

Figur 8: Relativ kondition målt ved hjælp af konkurrenceanalyser. Resultater af en- og tre-dages konkurrenceanalyser mellem LTEE-forfædre og 20.000 generation A-5 og A + 5 LTEE-populationer. Diagrammet til venstre viser de fire parvise konkurrencer som farvekodede dobbelthovedpile. Hver kombination af de to Ara⁻ (røde etiketter) og de to Ara⁺ (sorte etiketter) konkurrenter blev testet med seks gange replikation. Kolonitællinger fra tabel 1 blev analyseret i R ved hjælp af fitnessR-pakken³¹, og resultaterne blev plottet ved hjælp af ggplot2-pakken (version 3.4.0)³⁴. Fitness vises som den konkurrent, pilen i etiketten går mod i forhold til den konkurrent, pilen kommer fra (f.eks. REL8604 i forhold til REL606). Relative konditionsværdier estimeret ud fra kolonitællingerne for hver konkurrenceanalysereplikation (point), gennemsnitlige relative konditionsværdier for deltagerparret (søjler fyldt med samme farvekodning som diagrammet) og 95% konfidensintervaller (fejlbjælker) vises. Relative konditionsværdier kunne ikke bestemmes (N.D.) for de tre-dages konkurrencer mellem forfædrene og de udviklede populationer, fordi der var nul eller meget få kolonier af forfædrene på dag 3-pladerne (se tabel 1). Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1. Excel-regnearksfil til beregning af relativ fitness. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2. Skabelon til inputfil med kommaseparerede værdier til beregning af relativ egnethed i R ved hjælp af fitnessR-pakken. Klik her for at downloade denne fil.

LTEE's langsigtede modstandsdygtighed og dens metoder
E. coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) er nu i sit fjerde årti. For et mikrobielt evolutionseksperiment af enhver varighed er det afgørende at opretholde et reproducerbart miljø, undgå kontaminering, arkivere prøver og nøjagtigt måle fitness. LTEE demonstrerer flere tidstestede strategier for at nå disse mål, herunder brugen af godt rystede kolber, der skaber et homogent miljø og et kemisk defineret vækstmedium, der understøtter en lav celletæthed. Desuden anvender LTEE forfædrestammer, der adskiller sig i en genetisk markør, der giver en fænotype (kolonifarve), der både let screenes og selektivt neutral i evolutionsmiljøet. Denne eksperimentelle designfunktion giver mulighed for at identificere intern og ekstern kontaminering og letter måling af egnethed. Det er imidlertid ikke alle de procedurer og sikkerhedsforanstaltninger, der er blevet anvendt af LTEE siden 1988, der har vist sig at være lige robuste. Nogle metoder, der var pålidelige, da LTEE begyndte, er blevet mindre effektive, efterhånden som E. coli-populationerne har udviklet sig. Heldigvis kan disse problematiske metoder nu udvides eller erstattes ved hjælp af teknologier, der er udviklet siden eksperimentets start.

Detektering af kontaminering
Påvisning af kontaminering er afgørende for LTEE. Kontaminering kan være af to slags: mellem LTEE-populationer (krydskontaminering) og med mikrober fra miljøet (ekstern forurening). For det meste forhindrer omhyggelig brug af aseptiske teknikker og nøje opmærksomhed under medieforberedelse og de daglige overførsler begge typer kontaminering, men de sker. Tidligt i eksperimentet kunne plettering på TA-agar bruges til at detektere tilfælde af krydskontaminering, fordi overførsler altid har vekslet mellem ^{Ara-og Ara +} populationer. Fingeraftrykket af følsomhed og resistens af disse E. coli over for visse bakteriofager var også beregnet til at være et designelement, der kunne skelne LTEE-populationerne fra almindeligt anvendte E. coli-laboratoriestammer, der kunne forurene dem⁴. Disse genetiske markører er imidlertid blevet upålidelige, efterhånden som eksperimentet er skredet frem (f.eks. danner nogle populationer ikke længere kolonier på TA-agar)^10,35. Heldigvis har populationerne genetisk divergeret, da de har oplevet separate evolutionære historier under eksperimentet, hvilket har skabt nye genetiske markører, der nu kan bruges til at detektere krydskontaminering. For eksempel har hver population udviklet en unik kombination af mutationer i pykF- og nadR-generne 14,36,37. Nogle gange forstærker og sekventerer vi disse to gener for at teste, om kolonier med usædvanlige morfologier eller farver skyldes krydskontaminering. Da omkostningerne ved helgenom- og helpopulationssekventering fortsætter med at falde, kan rutinemæssig sekventering af LTEE-populationerne snart blive mulig, hvilket giver nye muligheder for at overvåge dem for tegn på kontaminering.

Måling af konkurrenceform
Et andet tilfælde, hvor LTEE er vokset ud af sine oprindelige metoder, er, at egnetheden af den udviklede E. coli er steget i forsøgsmiljøet i en sådan grad, at man ikke længere direkte kan måle egnetheden af nutidens befolkninger i forhold til deres forfædre ved hjælp af den her beskrevne protokol. De udviklede befolkninger udkonkurrerer forfædrene i en sådan grad, at få eller ingen forfædrekolonier er tilbage at tælle efter en en-dags konkurrence. En tilgang til at håndtere denne store fitnessforskel er at bruge ulige startforhold for stammerne og vægte de indledende volumener, der blandes mod den mindre egnede konkurrent (f.eks. 90 μL forfader og 10 μL udviklet konkurrent). En anden tilgang er at identificere en udviklet Ara-klon, der har en højere kondition end LTEE-forfaderen, isolere en spontan Ara⁺ revertantmutant af den ved selektion på ^MA-agar og derefter kontrollere, at revertantstammen har samme egnethed som sin forælder ved hjælp af et konkurrenceassay ^6,38. Dette nye Ara^−/Ara⁺ par kan derefter bruges som et sæt almindelige konkurrentstammer i stedet for REL606/REL607. Ideelt set vil den udviklede ^Ara-klon, der vælges som en fælles konkurrent (og dens Ara⁺ revertant), have mellemliggende egnethed i forhold til alle stammer af interesse i et eksperiment. I løbet af de første 50.000 generationer af LTEE producerede disse to tilgange (ved hjælp af ulige startforhold eller en fælles konkurrent) ikke meningsfuldt forskellige konditionsmålinger i forhold til den typiske tilgang³⁹.

Disse ændringer af konkurrenceprotokollen gør visse forenklede antagelser, som måske ikke altid er sande. Den ene er, at konditionsmålinger er transitive. Det vil sige, at hvis vi konkurrerer to populationer hver mod en fælles konkurrentstamme separat, kan vi udlede de to populationers relative egnethed til hinanden. Dette forhold har vist sig at være sandt for LTEE⁴⁰, for det meste, men det er det ikke for andre eksperimenter⁴¹. En årsag til denne uoverensstemmelse kan være udviklingen af negative frekvensafhængige fitnesseffekter. Denne situation opstår, når stammer isoleret fra to forskellige divergerende slægter fra befolkningen A-2 i LTEE konkurreres mod hinanden^19,42. Hver har en fordel, når den er sjælden, på grund af krydsfodring, hvilket stabiliserer deres sameksistens. Sekventering af data, der viser langsigtet sameksistens af slægter med forskellige sæt mutationer, tyder på, at lignende interaktioner også kan være opstået i andre LTEE-populationer^14,43, selvom det ikke er klart^, om de er stærke nok til mærkbart at ændre fitnessestimater. Endelig betyder udviklingen af aerob vækst på citrat i population A-3 af LTEE³², at disse cellers egnethed nu inkorporerer brugen af en "privat" ressource, når de konkurreres mod celler, der ikke kan bruge citrat, hvilket komplicerer fortolkningen af disse resultater. På trods af disse undtagelser har brugen af en lav glukosekoncentration og et godt rystet miljø utvivlsomt forenklet sammenligningen af LTEE-stammer og populationer.

Ved senere generationer danner nogle af LTEE-populationerne ikke længere kolonier på TA-agar, hvilket gør det vanskeligt eller umuligt at udføre konkurrenceeksperimenter ved hjælp af selv modificerede protokoller¹⁰. Alternative metoder, der ikke kræver kolonivækst, kan potentielt bruges til at bestemme den relative repræsentation af to konkurrenter, såsom FREQ-seq, der bruger næste generations sekventering til at tælle andelen af aflæsninger, der indeholder to alternative alleler i en amplicon⁴⁴. Denne metode eller en lignende metode kan potentielt bruges med Ara-allelerne eller med nyudviklede mutationer, såsom dem i pykF og nadR, versus forfædresekvensen. Udførelse af genetiske modifikationer, der introducerer andre typer neutrale markører, kan også bruges til at måle relativ kondition. For eksempel er fluorescerende proteingener blevet indsat i kromosomerne i celler i LTEE-offshoot-eksperimenter, så konkurrenter kan tælles ved hjælp af flowcytometri⁴⁵. En anden tilgang, der åbner mulighed for at blande mere end to stammer sammen i samme konkurrencekolbe, er at indsætte stregkoder, der kan PCR-amplificeres og sekventeres i genomerne hos forskellige konkurrenter. Denne tilgang er blevet brugt til afstamningssporing i evolutionseksperimenter⁴⁶. Både flowcytometri og stregkodesekventering kan nøjagtigt måle meget mere ekstreme forhold mellem to stammer versus kolonitælling (fordi de kan forespørge > 10.000 celler / genomer versus de < 500, der kan tælles på en agarplade), så brug af disse metoder lover også at øge det dynamiske område med hensyn til fitnessforskelle, der kan måles i forhold til en fælles konkurrent.

Alternative designs til langsigtede mikrobielle evolutionseksperimenter
På trods af alle sine dyder er LTEE ikke perfekt. Visse aspekter af dets design gør det arbejdskrævende og modtageligt for menneskelige fejl. For eksempel skal en forsker hver dag komme ind i laboratoriet og pipette mellem Erlenmeyerkolber for at fortsætte eksperimentet. Konkurrenceeksperimenter kan også udgøre skræmmende logistiske forhindringer, da kravene til sterile glasvarer, medier, inkubatorrum og kolonitælling hurtigt eskalerer, når selv et lille antal konkurrenter testes med beskeden replikation. Vi bliver ofte spurgt, hvorfor vi ikke udnytter laboratorieautomatiseringssystemer, såsom pipetteringsrobotter, der opererer på mikroplader med 96 brønde, eller kontinuerlige kultursystemer, såsom kemostater eller turbidostater. Svaret er enkelt: LTEE er på en måde en fange af sin egen lange historie. Vi tør ikke afvige fra 10 ml kulturer, der ryster med en bestemt hastighed i 50 ml Erlenmeyerkolber, fordi dette risikerer at ændre eksperimentet fundamentalt. Subtile aspekter af miljøet, som disse populationer har tilpasset sig i årtier (f.eks. Mængden af beluftning), ville blive ændret i mikroplader eller kontinuerlige kultursystemer. Populationsflaskehalsen ved hver overførsel kan også være forskellig (mindre i mikroplader, for eksempel), hvilket ændrer den evolutionære dynamik. Kort sagt ville afvigelse fra de metoder, der er beskrevet her, gøre LTEE til et andet eksperiment eller i det mindste risikere at indføre en diskontinuitet, der ville forstyrre evolutionære baner.

Forskere, der designer nye evolutionseksperimenter, bør overveje disse andre måder at formere mikrobielle populationer på, samtidig med at de er opmærksomme på deres potentielle fordele og ulemper. Brug af pipetteringsrobotter til at overføre populationer i mikrobrøndplader er logistisk enklere på nogle måder og kan vise sig ret kraftig på grund af det store antal replikate populationer, der kan formeres på denne måde^47,48,49. Automatiske overførsler i de fleste nuværende opsætninger finder dog ikke sted under helt sterile forhold, hvilket øger sandsynligheden for forurening udefra. For at forhindre forurening suppleres vækstmediet ofte med antibiotika, som bliver et træk ved miljøet, der påvirker evolutionen. Overførsler i mikrobrøndplader er også mere tilbøjelige til krydskontamineringshændelser. Endelig har miljøet af mikrobrøndplader - især hvis de ikke rystes - tendens til at vælge vægvækst, aggregering og andre fænomener, der kan komplicere evolutionen ved at skabe flere nicher i en brønd. Brug af rige medier eller høje koncentrationer af næringsstoffer til at holde populationsstørrelser store i små brønde vil sandsynligvis forværre disse kompleksiteter. Hvis sådanne interaktioner opstår, kan de gøre måling og fortolkning af fitness meget vanskeligere.

Kontinuerlige kultursystemer til mikrobiel udvikling omfatter kemostater, hvor frisk medium konstant pumpes ind og kultur pumpes ud, og turbidostater, hvor kulturer periodisk fortyndes gennem automatiseret sensing og pumpning for at opretholde celler i en tilstand af konstant vækst. Disse systemer er meget nyttige, når man ønsker at modellere mikrobiel fysiologi og evolution, fordi de undgår at have mikrober overgang mellem vækst og sult ved at holde dem i et miljø, der altid har næringsstoffer⁵⁰. Man kan endda tilføje sensorer, der foretager realtidsmålinger af optisk tæthed,_O2-forbrug, pH og andre aspekter af en kulturs miljø og vækst. Imidlertid kræver nuværende kontinuerlige kultursystemer enten dyre udstyrskøb eller specialiseret ekspertise til at opbygge brugerdefinerede opsætninger^51,52,53,54. Også vægvækst, hvor celler undslipper fortynding ved at klæbe til kulturkammeret, ødelægger evolutionær dynamik i kontinuerlige kultursystemer, medmindre de periodisk steriliseres. På grund af disse begrænsninger har de fleste kemostat- og turbitostatevolutionseksperimenter til dato været af begrænset varighed og/eller involveret relativt få uafhængigt udviklende populationer sammenlignet med eksperimentelle overførselsevolutionseksperimenter.

Konklusion
De metoder, vi demonstrerer her for LTEE, er afgørende for at studere dens unikke historiske rekord og fortsætte den åbne udvikling af disse E. coli-populationer. De giver også et udgangspunkt for andre, der overvejer nye evolutionseksperimenter, der kan drage fordel af laboratorieautomatisering eller tilføje forskellige elementer af kompleksiteten, der findes i naturlige miljøer, der bevidst blev udeladt fra LTEE. Siden 1988 har eksperimentel evolution blomstret som et felt. I løbet af denne tid har forskere i laboratorier over hele kloden demonstreret den enorme fleksibilitet i denne tilgang til at studere evolution, innovere ved at introducere kreative eksperimentelle designs og overvåge resultaterne ved hjælp af nye teknologier. LTEE's metoder repræsenterer ikke et endepunkt, men vi håber, at de vil fortsætte med at inspirere og skabe et fundament for feltet langt ind i fremtiden.